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Forbici Molecolari per fermare l’HIV

Posted by fidest press agency su sabato, 8 ottobre 2016

philadelphiaDa più di tre decenni, in seguito alla scoperta del virus HIV-1, l’AIDS rappresenta un gravissimo problema di salute pubblica, che coinvolge più di 35 milioni di persone nel mondo. Le attuali terapie antiretrovirali, pur essendo clinicamente efficaci, non sono in grado di eliminare l’infezione da HIV-1, sia per l’elevata variabilità genomica del virus che a causa della sua persistenza all’interno di diversi reservoir cellulari. Per questo motivo le ricerche in questo ambito si sono orientate verso lo sviluppo di nuove strategie che permettano di eradicare il DNA provirale che si integra durante la replicazione dell’HIV stabilmente nel genoma delle cellule infettate. Il gruppo di ricerca del Department of Neuroscience della Temple University di Philadelphia, guidato dal professor Kamel Khalili, in collaborazione con il professor Pasquale Ferrante del Dipartimento di Scienze Biomediche, Chirurgiche ed Odontoiatriche dell’Università degli Studi di Milano, ha sfruttato la tecnologia Cas9/guide RNA (gRNA) per separare specificamente il genoma di HIV-1 dalle cellule infettate persistentemente, sopprimendo così l’espressione genica e la replicazione virale nelle cellule della microglia, nei promonociti e nelle cellule T. In questo modo il professor Khalili, lavorando su cellule infette provenienti da pazienti HIV positivi, ha dimostrato la possibilità di eradicare il genoma del virus dalle cellule infette.
Nello studio recentemente pubblicato su Gene Therapy (2016, 23: 690-695) è stata adottata una versione modificata della tecnologia, denominata saCas9: l’endonucleasi Cas9, insieme a diverse gRNAs è stata utilizzata per rimuovere segmenti clinicamente importanti del progenoma di HIV-1, ossia le sequenze comprese tra l’estremità LTR al 5’ e il gene Gag. Il sistema saCAs9/gRNA è stato veicolato grazie ad un vettore ricombinante adenovirale, iniettato nella coda di topi transgenici ed il risultato ottenuto è stato soddisfacente, dal momento che si è ottenuta l’asportazione delle 978 paia di basi di HIV-1, che rappresentavano il target genomico prescelto, in tutti i tessuti murini analizzati: milza, fegato, cuore, polmoni, reni e linfociti circolanti. In questo modo, per la prima volta, è stato dimostrato che è possibile togliere in vivo il genoma provirale di HIV-1, mediante il sistema CRISPR/Cas9 veicolato da un vettore adenovirale, in grado di raggiungere tutti i distretti corporei infetti.
In pratica i ricercatori Khalili e Ferrante, attraverso una specifica tecnologia, cercano di eliminare il genoma del virus HIV-1 dalle cellule infettate, sopprimendo così la replicazione virale nei luoghi in cui il virus si nasconde anche quando non è identificabile nel sangue (le già citate cellule della microglia, promonociti e cellule T del sangue). Nei topi, grazie ad un adenovirus che ha portato le informazioni, si sono eliminate le basi chiave del patrimonio genetico per la replicazione del virus. I nuovi risultati degli studi Khalili – Ferrante pubblicati dalla rivista Scientific Reports.
Il professor Kamel Khalili ha illustrato oggi i nuovi risultati raggiunti dal suo gruppo di ricercatori dei quali fa parte anche la dottoressa Ramona Bella, dottoranda di Medicina Molecolare e Traslazionale presso l’Università degli Studi di Milano. Il team che in Italia conta sul lavoro del professor Ferrante ha raggiunto nuovi considerevoli risultati nella lotta contro l’infezione da HIV-1.
La tecnologia gene editing, basata sull’attività del complesso molecolare CRISPR/Cas9, già messa a punto per l’asportazione del genoma del virus HIV-1 dall’ospite, è stata ulteriormente migliorata, permettendo lo sviluppo di una strategia che induca l’attivazione dell’enzima Cas9 solo in concomitanza con le prime fasi della replicazione virale. Questo è stato possibile facendo in modo che sia una proteina del virus stesso, la proteina Tat, a promuovere l’esclusione del genoma virale, attivando l’intervento di Cas9. La conseguenza di questa innovazione è il blocco della replicazione virale, ancora prima che essa diventi produttiva, oltre alla diminuzione dei possibili effetti collaterali, dovuti all’espressione continua di Cas9.
Il professor Pasquale Ferrante del Dipartimento di Scienze Biomediche, Chirurgiche ed Odontoiatriche dell’Università degli Studi di Milano e Direttore Scientifico dell’Istituto Clinico Città Studi ha sottolineato che: “i risultati di questi studi, a differenza di altre terapie che riducono o bloccano la replicazione senza però eliminare il virus, mirano all’eradicazione dell’HIV. Ciò comporterà una diminuzione dei costi per le terapie a fronte di esiti sicuramente positivi nella cura dei pazienti. Va ricordato che questi risultati sono stati resi possibili dopo i fondamentali studi realizzati da diversi ricercatori tra il 2007 e il 2012 che hanno portato all’utilizzo mirato di Cas9, le cosidette forbici molecolari.
Nel prossimo futuro, evidenzia il professor Ferrante, continueremo la ricerca per perfezionare i risultati al fine di ottenere l’autorizzazione della FDA per iniziare il percorso verso la sperimentazione sull’uomo che speriamo possa essere avviata tra pochi anni. Ricordo infine, che questo convegno è stato reso possibile grazie all’intervento dell’Istituto Clinico Città Studi, ospedale che dedica forte attenzione alla ricerca in diverse aree mediche. ICCS, che ha finanziato un posto di Ricercatore Universitario a Tempo Determinato, a favore della dottoressa Serena Delbue, relatrice al convegno odierno, patrocina numerose pubblicazioni e congressi scientifici e finanzia Borse di Studio a favore degli specializzandi dell’Università degli Studi di Milano”.

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Forbici molecolari intrappolate in labirinti di dna

Posted by fidest press agency su domenica, 22 maggio 2011

Trieste. Nuovi sviluppi nelle nanotecnologie molecolari applicate alle scienze della vita. Sulla rivista Nature Communications un team interdisciplinare di ricercatori, tra cui Matteo Castronovo della Temple University (Philadelphia) e Giacinto Scoles, professore alla Sissa fino a novembre scorso, ha appena pubblicato i risultati di uno studio che illustra i meccanismi con cui gli enzimi di restrizione interagiscono con il DNA in nanostrutture molecolari. Si tratta di un’importante classe di enzimi che, comunemente impiegati nelle biotecnologie come nell’ingegneria genetica, riescono a tagliare il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche di nucleotidi (i mattoncini di base della struttura a doppia elica: A, T, C, G), accorciandolo con altissima precisione. Tagli che vengono rivelati con microscopi a scansione.Per la prima volta è stato individuato che questi enzimi vengono letteralmente intrappolati all’interno di tali strutture conservando la loro funzionalità: scorrono lungo la doppia elica del DNA come se fosse un binario, finché non trovano il sito di restrizione, cioè una sequenza specifica su cui fermarsi e che, conseguentemente, tagliano a metà. La scoperta può aprire nuovi scenari per la medicina molecolare di frontiera e favorire lo sviluppo di nanotecnologie a basso costo, usando strutture composte da molecole di DNA, utili per esempio per l’analisi di singole cellule tumorali circolanti nel sangue o microdissezioni ricavate da biopsie. Biomolecole in campioni biologici molto piccoli che attualmente non è possibile analizzare, ma che potrebbero essere facilmente misurate utilizzando sensori miniaturizzati, dalle dimensioni più piccole di una singola cellula, capaci di intrappolarne il contenuto biomolecolare e di studiarne le caratteristiche. I ricercatori, usando metodi di manipolazione molecolare, hanno studiato l’interazione degli enzimi di restrizione con la doppia elica del DNA, in condizioni particolarmente diverse da quelle esplorate finora. Hanno utilizzato molecole dell’acido desossiribonucleico, corte una decina di nanometri, per costruire delle matrici simili a dei boschetti, formati da una “distesa” di paletti verticali su una superficie liscia. E hanno scoperto che quando la densità dei paletti di DNA è sufficientemente alta da formare una matrice ordinata, gli enzimi possono accedervi solo dai suoi bordi laterali, mediante diffusione.
«Abbiamo individuato che all’interno delle matrici, gli enzimi si diffondono bidimensionalmente: cioè gli enzimi attraversano la matrice da un lato all’altro restando intrappolati al suo interno, anche per centinaia di micrometri, attraversando distanzecentinaia o decine di migliaia di volte il loro diametro» spiega Castronovo, che ha coordinato, per due anni, ricercatori delle Università di Temple (USA), Ancona e Trieste, della Sissa, della Sincrotrone Trieste, del Consorzio di Biomedicina Molecolare di Trieste e dell’Ospedale di Cattinara, con competenze in chimica, fisica, biologia molecolare, medicina ed ingegneria chimica ed elettronica. Dal punto di vista fisico questa scoperta è molto sorprendente per due ragioni: finora non era mai stato osservato un meccanismo di questo tipo nell’interazione tra biomolecole su superfici. «E in secondo luogo, la diffusione 2D degli enzimi avviene spontaneamente, senza il bisogno di introdurre delle forze esterne per veicolare le biomolecole come, per esempio, un campo elettrico, come avviene nella maggior parte dei sistemi miniaturizzati per le analisi biologiche noti come lab-on-a-chips, che rappresentano una frontiera nella ricerca biomedicale verso l’analisi di tessuti biologici piccolissimi» precisa Scoles. «Questo – continua Castronovo – potrebbe gettare le basi per generare vere e proprie trappole molecolari costituite da appena 10.000 molecole e, per di più, attive, cioè che non necessitano di una sorgente di alimentazione esterna per funzionare».
Il DNA infatti, oltre a essere alla base del funzionamento degli organismi viventi, è anche un prezioso materiale per produrre dispositivi “intelligenti”: sistemi macromolecolari con forma variabile a piacere, di dimensioni comprese tra alcune decine e alcune centinaia di nanometri. Auto-assemblandosi, infatti, forma la ben nota struttura a doppia elica grazie al riconoscimento tra filamenti contenenti sequenze di basi complementari tra loro. Inoltre, le funzioni del DNA dipendono dalla sua capacità di interagire con una vastissima classe di proteine che riconoscono sequenze di DNA specifiche e diverse tra loro.
La ricerca è stata condotta con finanziamenti della Regione Friuli Venezia Giulia, della Sissa -Istituto Italiano di Tecnologia, dalla Fondazione Cassa di Risparmio di Trieste, dalla Fondazione Casali (Trieste) e, negli USA, con un finanziamento dell’Università di Temple.
(Matteo Castronovo, Agnese Lucesoli, Pietro Parisse, Anastasia Kurnikova, Aseem Malhotra, Mario Grassi, Gabriele Grassi, Bruna Scaggiante, Loredana Casalis, & Giacinto Scoles Nature Communications doi:10.1038/ncomms1296)

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